3. Preparo para Microinjeção

Em uma placa de Petri Falcon (1006), são colocadas 1 gota central de 5ml de ICSI 100 ( para imobilizar os espermatozóides ) rodeadas por 8 gotas de 5ml de meio de injeção Gamete 100 e cobertas com óleo mineral OVOIL 150. São colocados no ICSI 100 , 1-2ml da amostra seminal já capacitada e nas gotas ao redor 1 oócito em cada gota.

O procedimento do ICSI é realizado sobre uma platina aquecedora à 37°C acoplada ao microscópio invertido Nikon (Eclipse) com aumento de 200-400X , usando um contraste de fase Hoffman. O microscópio é equipado com sistema de videocâmera e monitor de vídeo onde o procedimento pode ser acompanhado.

Um único espermatozóide é selecionado e imobilizado mecanicamente com uma leve pressão da pipeta de injeção sobre a sua cauda. A cauda é então aspirada para dentro da pipeta de injeção.

Com a pipeta de sucção ("holding" ) , o primeiro corpúsculo polar é colocado na posição de 6 horas ( dependendo da abertura da agulha de injeção ). O oócito é então fixado com uma pequena sucção da pipeta de "holding". Com apenas 1 espermatozóide imobilizado dentro da pipeta de injeção, injeta-se em posição de 3 horas. Após a introdução da pipeta dentro do ooplasma o mesmo é levemente aspirado para certificação da quebra da membrana citoplasmática e ,logo após a quebra, o espermatozóide é colocado juntamente com o ooplasma.

Após a injeção , os oócitos são lavados em meio IVF 50 e colocados juntos em uma placa de Petri com centro Falcon (3037) com 1 ml de meio IVF 50 coberto com óleo mineral e colocados na incubadora até a verificação da fertilização.

4. Verificação da Fertilização

A verificação da fertilização é feita entre 16-18 horas após a ICSI, através do microscópio invertido em aumento de 400X. É verificada a presença de prónucleos e corpúsculos polares e presença de anormalidades na fertilização ( ausência de prónucleos, mais de dois prónucleos, degenerações, etc.)

A fertilização é considerada normal quando dois prónucleos forem visualizados , contendo nucléolos em seu interior. Se apenas um prónucleo for visualizado, uma segunda avaliação é feita após 4 horas. Quando for detectada a presença de três ou mais prónucleos (PN), esse embrião é imediatamente descartado.

Os oócitos fertilizados são lavados em meio G1.2 e agrupados de 2 em 2 em placas de Petri sem centro com gotas de 50ml de meio G1.2 e cobertas com óleo mineral. As placas são colocadas novamente na incubadora e permanecem nesse mesmo meio de cultura até 72 horas após o ICSI ( Dia 3 ). Não é necessário o acesso aos embriões em 48 horas, evitando a abertura constante da incubadora que pode prejudicar a cultura dos mesmos.

Caso a transferência seja realizada no dia 3 ( 72 horas ), os embriões deverão permanecer em meio de cultura IVF 50 até 48 horas e deverá ser feita a renovação do mesmo meio após esse período até 72 horas.